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兔子肿瘤坏死因子αELISA试剂盒原理
更新时间:2012-12-13      阅读:1957

 

兔子肿瘤坏死因子αELISA试剂盒实验原理:

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中兔肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。用纯化的兔肿

瘤坏死因子α(TNF-α)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入肿

瘤坏死因子α,再与 HRP 标记的羊抗兔抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻

底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成

zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的兔肿瘤坏死因子α呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下

测定吸光度(OD 值),通过标准曲线计算样品中兔肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度。

兔子肿瘤坏死因子αELISA试剂盒操作步骤:

1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔 10孔,在*、第二孔中分别加标

准品 100μl,然后在*、第二孔中加标准品稀释液 50μl,混匀;然后从*孔、第二

孔中各取 100μl 分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μl,

混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 弃掉,再各取 50μl 分别加到第五、第六孔

中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各

取 50μl 分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl,混

匀后从第七、第八孔中分别取 50μl 加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准

品稀释液 50μl,混匀后从第九第十孔中各取 50μl 弃掉。(稀释后各孔加样量都为 50μl,

浓度分别为 15μg/L,10μg/L ,5μg/L,2.5μg/L,1.25μg/L)。

2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样

品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl,然后再加待测样品 10μl(样

品zui终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混

匀。

3. 温育:用封板膜封板后置 37℃温育 30分钟。

4. 配液:将 20倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。

5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置 30 秒后弃去,如此

重复 5 次,拍干。

6. 加酶:每孔加入酶标试剂 50μl,空白孔除外。

7. 温育:操作同 3。

8. 洗涤:操作同 5。

9. 显色:每孔先加入显色剂 A50μl,再加入显色剂 B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色

15分钟.

10. 终止:每孔加终止液 50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11. 测定:以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。 测定应在加终止

液后 15分钟以内进行。

兔子肿瘤坏死因子αELISA试剂盒注意事项:

1)在收集标本前都必须有一个完整的计划,必须清楚要检测的成份是否足够稳定。

2)我们提倡新鲜标本尽早检测,对收集后及时进行检测。说明:

样品类型: 标本必须为液体,不含沉淀。包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等。1ml的全血可得到0.5ml的血清 或血浆。每个标本量收集体积=100ul×检测种类。取材前须向销售人员索要说明书。 

样品采集: 收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本,储存在4℃备用,如有特殊原因需要周期收集标本, 将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。避免反复冻融。标本2-8℃可保存48小时,-20℃可保存1个月。-70度可保存6个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。四、液体类标本:

包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

1)血清:

室温血液自然凝固10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

2)血浆:

应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

3)尿液:

用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

4)细胞培养上清:

A、检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/ 分)。仔细收集上清。

B、检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并 放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

5)组织标本:

切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

 

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