人ELISA试剂盒血清是最-常用的标本,血浆一般可视为与血清同等的标本,标本引起的假阳性和假阴性结果主要由干扰性物质影响所致,分为内源性物质和外源性物质两种:
一、内源性物质
常见的干扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。
1.类风湿因子:
人血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合,从而导致假阳性。
解决办法:
(1)用F(ab)2替代完整的IgG;
(2)标本用联有热变性(63℃,10 min)IgG的固相吸附剂处理(将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效)。
2.补体:
ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中,抗体分子发生变构,其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来,使C1q可以将二者连接起来,从而造成假阳性。
解决办法:
(1)用EDTA稀释标本;
(2)用53℃,10 min或56℃,30 min加热血清使C1q灭活。
3.嗜异性抗体:
人类血清中含有能与啮齿类动物(如鼠等)Ig(s)结合的天然嗜异性抗体,可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来,也能造成假阳性。
解决办法:可在标本稀释液中加入过量的动物Ig(s),但加入量不足或亚类不同时无效。
4.嗜靶抗原的自身抗体:
抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体,有时能与靶抗原结合形成复合物,在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。
解决办法:测定前需用理化方法将其解离后再测定。
5.医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体:
人ELISA试剂盒临床开展的用鼠源性CD3等单克隆抗体治疗,用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术,均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体;被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig(s)抗体。这些病人ELISA测定时均可产生假阳性。
解决办法:测定抗原时,在标本中加入足量的正常鼠Ig(s)。
6.标本中其它成分的影响血清脂质过高、胆-红素、血红蛋白及血液粘度过大等,均ELISA测定结果产生干扰作用。
二、外源性物质
外源性物质常常是由用ELISA测定的血标本的采集、贮存不当等原因导致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响。
1.标本溶血:
由于各种人为原因引起的标本溶血,均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白,在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中,会导致非特异性显色,干扰测定结果。故标本采集时必须注意避免溶血。
2.标本受细菌污染:
因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,因此,被细菌污染的标本同溶血标本一样,产生非特异性显色而干扰测定结果。
3.标本保存不当:
在冰箱中保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体,在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性;标本放置时间过长(如一天以上),有时抗原或抗体免疫活性减弱,亦可出现假阴性。
解决办法:
(1)ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集;
(2)如不能立即测定,5天内测定的血清标本可存放于4℃,1周后测定的血清标本应低温冻存;
(3)冻存后融解的标本,蛋白质局部浓缩分布不均,应充分混合后再测定(混匀时不可强烈振荡)。
4.标本凝集不全:
在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下,正常血液采集后1/2~2h开始凝固,18~24h凝固。临床检验工作中,有时为争取时间快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果。
解决办法:血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。
5.人ELISA试剂盒标本管中添加物质的影响:
抗凝剂(如肝素,EDTA)、酶抑制剂(如NaN3可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性)及快速分离血清的分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。
通过以上的分析和总结,从标本因素进行分析,并采取相应措施排除干扰,从而确保检测结果的准确性。