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细胞株纯化方法
更新时间:2024-07-19      阅读:445

(1)纯化法

在去除不需要的组织后,使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4 mm小片,通过悬浮在无钙镁的中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀,去除上清液。重复清洗2~3次。将盛有组织碎片的容器置于冰上,去除残留的上清液。加入0.25%溶解在无钙镁的(100 mg组织加入1ml )。在4℃孵育6~18h,使几乎没有活性的酶尽可能渗透进去。移弃组织碎片中在37℃孵育包含残留的组织碎片20~30分钟。在组织碎片加入热的培养基,用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基,要加入大豆抑制剂。

通过无菌不锈钢丝网(100~200 mm)过滤,分散所有剩余组织,计数和接种细胞,进行培养。

 

(2)胶原酶纯化法

用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片,用平衡液清洗组织碎片几次。加入胶原酶(50~200单位/ml,溶解在平衡液中),在37℃孵育4~18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的胶原酶。通过离心在平衡液中清洗悬液几次。再一次在培养基中悬浮细胞,计数和接种细胞,进行培养。

 

(3)Dispase纯化法

用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片,用不含钙镁的清洗组织碎片几次。加入Dispase(0.6~2.4单位/ml 溶解在无钙镁的)在37℃孵育20分钟~几个小时。通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液,以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚,在碎片中加入新鲜的Dispase。

通过离心在中清洗悬液几次,再一次在培养基中悬浮细胞,计数和接种细胞,进行培养。

分离细胞后,首-次传代需要注意的问题:

传代培养时先观察细胞的活性。细胞的活率应该超过90%,密度控制在80%左右。


对于无血清培养基,需要降低使用量。

1. 移弃使用过的细胞培养基。

2. 使用不包含有钙镁的或EDTA清洗细胞。在培养瓶背着细胞的一面加入清洗溶液,通过转动培养瓶1~2分钟清洗细胞层,然后去除清洗液。

3. 加入消化,消化细胞与细胞,操作手法,试剂的效价有密切的关系,消化时应注意观察细胞形态,如细胞变得椭圆透亮,并且可以观察到细胞与细胞间的间隙时,轻拍瓶身可以看见成流沙状,即可中止消化,消化时尽量减少对细胞的吹打。

4. 当细胞分离时,垂直放置培养瓶,让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入培养基中止消化,计数并再次培养细胞。

5. 对于无血清培养基,加入大豆抑制剂。通常使用1∶1(v∶v)0.25 mg/ml抑制剂到中将抑制活性。

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