游离脂肪酸（NEFA）测试盒

一．试剂盒说明

游离脂肪酸能与铜离子结合形成脂肪酸的铜盐而溶于氯仿中，其含量与游离脂肪酸含量成正比。用铜试

剂测定其中铜离子的含量，即可推算出游离脂肪酸的含量。 注意：此实验必须用玻璃试管，不能用半自动及全自动生化分析仪比色。

二．试剂盒组份

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注意：

1.试剂三：临用时以甲液：乙液：丙液=10:9:1 混合配成铜试剂，需多少配多少，配好后 4℃保存二周。

2.试剂五：1000μmol/L 棕榈酸标准品的配制：将一支粉剂用溶剂溶解后定容至 20ml，混匀.（注意需用溶剂 将装粉剂的小离心管洗净）

三．操作步骤

附：详细操作步骤：

1、 充分混匀准确抽提 2 分钟（用秒表计时）。如果您没有磨口试管，可用普通玻璃试管代替，但必须用保 鲜薄膜封口，以便防止液体会发及溅出。

2、 抽提完后以 3500 转/分，离心 10 分钟，若发现下层液体呈半凝固状态、凝固层较厚或下层液体不足 2ml

时，则可用小玻棒或移液器吸嘴轻轻搅拌后再次离心，直至分层清楚。

3、 然后用注射器接上硬膜外麻醉针套吸取上层液体及凝固层并弃之。

4、 另取一个注射器及硬膜外麻醉针心针套，将硬膜外麻醉针心插入针套中，小心插入下层抽提液中，拔出 针心，接上注射器吸取下层抽提液 2.3ml-2.5ml 至另一试管中。（这样可避免上层液体及凝固层混入下层 液体中，若混入上层液体及凝固层，则需要重新离心后再去下层抽提液，否则会影响结果。）若偶然发现 抽提液有雾状混浊，可放入 37℃水浴 1-2 分钟即可。

5、 再从上述试管中用玻璃移液管准确吸取 2ml 下层抽提液加入另一试管中，加显色剂进行显色。

6、 比色皿在用双蒸水冲洗干净后，还必须用无水乙醇冲洗，然后加试剂一调零，否则加入的试剂一中会混 有水珠（试剂一和水不互溶）。

7、 操作工程中只能用玻璃管，不能用熟料材质的试管代替。 以上七点为实验成败的关键。

四．计算公式及举例

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五．注意事项

1.实验必须用玻璃管和普通分光光度比色，不可用熟料事关和半自动及全自动生化分析仪比色（有机溶 剂对半自动及全自动生化分析仪会有损坏）。

2.显色前吸取下层抽提液时，习惯不要触及管壁，以免沾染管壁上粘着的铜试剂。下层抽提液必须清澈， 否则会使结果偏高。

3.胆红素可被试剂一抽提而干扰比色，故黄疸血清须做一对照管，即zui后不加显色剂而用正丁醇代替， 在测定管光密度读数中减去此对照管的光密度读数。

附录：实验中可能出现的问题

在做脂肪酸的时候空白很高，也有的老师操作结果中标准和测定结果都很高，甚至能达到 3.000 以上， 大多数情况下是由于操作问题引起的，下面是关于 NEFA 实验所要注意的几个问题：

1. 在做组织样本的时候，不能将样本一起做成匀浆，因为组织在做成匀浆后，很多指标含量都会快速 下降，一般应该是上午做好匀浆，下午就要测定完，样本太多一次不能操作完的，当天能做几个样本就 做几个匀浆，是按分组取样，每组均要样本参与，这样能减少批间差。

2. 关于移液枪的使用，建议刚做实验的老师，用倒退法加样，以便减少误差。并且在实验前能够 多加练习，如反复蒸馏水，当加样熟练后，可进一步用无水乙醇和血清进行练习，这样可以提高加样的 准确性。

3.   在 NEFA 的混匀过程中，用橡皮塞塞住试管后，按住试管上部混匀。切忌握住试管中部或者下 部，因为这样会使混匀不充分，导致抽提不充分。

4. 实验时所用器皿应当仔细洗刷并且烘干，如果有污染，则可能会对实验造成不必要的损失。例如： 在配制铜试剂时，烧杯不干净，则可能导致配制出的铜试剂混浊，而非澄清透亮。如果在实验过程中试 管不干净，也可能引入杂蛋白，甚至造成空白管也能出现中间蛋白层的现象。

5. 试剂配制时应按照说明书的顺序进行。例如：在铜试剂配制时，如果按照打乱顺序配制，即不按照 甲乙丙的顺序，那么也有可能会使配制好的铜试剂出现浑浊现象，从而不能使用。

6. 实验时的自备试剂不能有污染，特别是蒸馏水，很多实验失败都是因为zui容易忽略的蒸馏水受到了 污染，引入杂离子或者杂蛋白。

7.   离心后的上层铜试剂建议客户用一次性注射器吸出。在吸下层抽提液时，应该用适当大小的穿刺针， 如果穿刺针过大，例如用牛的穿刺针，有可能携带过多的上层铜试剂或者中间的蛋白层，如果吸到上层 的铜试剂，在比色中会使吸光度特别高，一起结果偏差很大，并且做不同试验时所用的穿刺针不应交叉 使用，每隔实验所用的玻璃移液管或者穿刺针能够固定不变。

8. 在比色过程中，应保证分光光度计使用恰当无误。比方说有的老师再调零时，只用一个比色皿调零， 另一个比色皿有冲洗和调零就直接使用，会造成初始值就偏高的现象，因为比色皿会吸附颜色。

9. 在配制试剂过程中，能够严格按照我们说明书上的量进行准确量取，以加强实验的准确性，不 能随便倒取。