活性蛋白提取试剂盒使用操作说明
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For Research Use Only
一、 试剂盒说明
本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取具有活性的全蛋白, 用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液
Lysis Buffer 匀浆裂解组织或细胞,作用温和,提取过程简便。获得的全蛋白可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶 的活性的测定的等后续研究,但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究,因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂。 应用方面:可用于 Western Blot、免疫共沉淀和酶活性测定等后续研究.
二、试剂盒组份
组份 | KGP1050 50 tests | KGP10100 100 tests | 储存温度 |
Lysis Buffer | 50mL | 100mL | 2-8℃ |
磷酸酶抑制剂 | 500μL | 1000μL | -20℃ |
蛋白酶抑制剂 | 50μL | 100μL | |
PMSF(100mM) | 500μL | 1000μL | -20℃,避光 |
三、操作步骤
Ⅰ 实体组织蛋白的提取
1. 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10 μL 磷酸酶抑制剂,1 μL 蛋白酶抑制剂和 10μL PMSF,混匀。冰上保存数分钟待 用。
2. 每 100mg 固体组织置于培养皿中,手术剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小块,加入 0.5~1 mL 冷 Lysis Buffer,玻 璃匀浆器上下手动匀浆 15 次,注意低温操作;
3. 取组织匀浆液转移到 1.5mL 预冷的离心管,离心 10000 转/分,4℃离心 5 min;
4. 取上清转移至新的预冷的离心管中,即为全蛋白提取物,蛋白定量(Bradford 法、BCA 法);
5. 分装保存于-70℃,避免反复冻融。
Ⅱ 培养细胞蛋白提取
1. 贴壁培养的细胞,吸去培养基后,加入 10mL/150mm 培养板的冷 PBS 洗两次,每次振摇数次以尽量去除培养液;
2. 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞,将细胞及培养液移至离心管中,1000 转/分离心 10 min,再用
10mL/150mm 培养板的冷 PBS,1000 转/分离心 5 min 洗两次;
3. 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10μL 磷酸酶抑制剂,1μL 蛋白酶抑制剂和 10μL PMSF(用户自配:浓度 100mM, 溶于异丙醇),混匀。冰上保存数分钟待用。
4. 在上述培养板或离心管的细胞中,加入上述配制好的冷 Lysis Buffer,加入量如下表所示:
细胞数量 | Lysis Buffer 加入量 |
107 个 | 0.5 mL~1 mL |
5×106 个 | 0.2 mL~0.5 mL |
5.冷室或冰上操作,贴壁细胞用细胞刮子刮下,皆 Lysis Buffer 一同转移至新的预冷的离心管中;悬浮培养或裂解
前刮下的贴壁细胞皆 Lysis Buffer 一同转移至新的预冷的离心管中,
6.置于 4℃摇床平台上,温和振荡 15 min;
7. 14,000rpm,4℃离心 15min,取上清为全蛋白提取物, 蛋白定量(Bradford 法、BCA 法);
8. 分装保存于-70℃,避免反复冻融。
四、注意事项
? 所有接触样品的用具及试剂均需预冷。
? 提取蛋白后,如有必要,可透析除去表面活性剂