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BIM知识课堂:Western化学发光检测常见问题
更新时间:2016-10-25      阅读:2785

底物化学发光ECL是Western blotzui常用的显色方法之一,其原理是辣根过氧化物酶在H2O2的作用下,氧化化学发光物鲁米诺(Lumino)并发光,在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍,通过在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。

Fig:ECL发光检测原理示意图


ECL法具有操作简单,灵敏度高,线性范围广等特点,现将该方法使用中zui常出现的问题以及解决方法汇总如下:

现象原因解决办法
信号弱或无HRP过高引起底物迅速耗竭稀释一抗/二抗
抗体-抗原系统敏感性过低提高抗体浓度/蛋白上样量
转膜不充分/过转优化转膜条件
HRP或底物活性降低测试活性或选用敏感底物
高背景HRP过高(背景较高)稀释一抗/二抗
封闭时间不足延长封闭时间4度过夜
抗体与封闭液有交叉更换封闭液(如3% BSA的TBST)
TBST洗脱不足增加洗脱时间、次数、用量
曝光时间过长降低曝光时间
抗原-抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量
条带内无显影的白点转膜不良(如有气泡在胶-膜之间)精细操作
膜平衡不均/油脂污染按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜
膜与X光片间有气泡显影前去除气泡
非特异性条带抗体交叉反应稀释一抗/二抗
散在小圆斑封闭液有杂质颗粒静置牛奶使大颗粒沉淀,仅用上层
反影(白色条带,黑色背景)HRP过高(背景较高)稀释一抗/二抗
显影后膜上条带处变为黄色HRP过高(敏感性太高)稀释一抗/二抗


上海劲马实验设备有限公司试剂盒产品特点:

⇒ 高灵敏度的非放射性检测系统:可检测低至100fg~1pg的抗原,适用于痕量抗原的检测。

⇒ 高分辨率:本底极低,即使长时间曝光,背景仍然极低,远远优于国产与进口同类产品。

⇒ 半衰期长:信号衰减慢,12个小时以上仍可感光X光胶片。

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