DyLight 594是一种橙红色荧光团,其zui大吸收波长在593nm,相应的zui大发射波长是618nm。DyLight荧光染料是通过将磺酸酯加成到香豆素、呫吨类 (如FITC和罗丹明)以及花箐素类荧光染剂上而成,磺酸酯使DyLight带负电荷并呈亲水性。与传统的荧光团,如FITC、罗丹明以及Cy3和Cy5 等相比,DyLight荧光染料具有较宽的激发和发射波段,几乎覆盖了所有的可见光区域,包括蓝色、绿色、黄色、橙色、红色,以及近红外和远红外波段,因 此可用于大部分荧光显微镜以及远红外成像系统。并且与传统的荧光团相比,具有发光亮度更强,灵敏度更高,背景更低的优势,同时其对pH的稳定性更好,发光 也更持久,因此更适合于拍照。DyLight荧光荧光染料作为荧光显微镜、细胞生物学和分子生物学内的生物分子、细胞和组织标记物,可应用于生物技术和研 究等众多领域。
Cy2耦联基团激发波长为492nm,发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片,但是要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂,因为这种抗淬灭剂和Cy2反应,在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy2属于花菁类染料 (Cyanine Dyes),常见的Cy系列染料主要包括有Cy2、Cy3、Cy5等,能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素类似,但水溶性和对光稳定性较强,荧光量子产率较高,对pH等环境不敏感。常用于多重染色。与FITC相比,Cy2的荧光强度更大,光稳定性和抗萃灭性更好。
FITC(Fluorescein Isothiocyanate,异硫氰酸荧光素)纯品为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4,zui大吸收光波长为 490~495nm,zui大发射光波长为520~530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年,是目前应用zui广泛的荧光素。由于 FITC是小分子化合物,每一个抗体可标记几个FITC分子,IgM通常用小分子的荧光素标记,如FITC、Cy3/5、Texas Red等。然而FITC的zui大缺点是淬灭快,因此要和抗淬灭剂一起使用。FITC性质稳定,能与蛋白质结合,是检测组织细胞内蛋白质zui常用的荧光探针。它 还能标记抗体,可用于免疫组织化学单染或多重染色。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感,通常切片标本中的绿色荧光少于红色。缺点是在光照下 易淬灭,易受自发荧光影响。
Cy5zui大激发光波长为649nm,zui大发射光波长为680nm,呈红色荧光。Cy5属于花菁类染料(Cyanine Dyes),常见的Cy系列染料主要包括有Cy2、Cy3、Cy5等,能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素类似,但水溶性和对光稳定性较强,荧光量子产率较高,对pH等环境不敏感。常用于多重染色。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮,更稳定,背景更弱。由于Cy5的zui大发射波长为680nm,很难用裸眼观察,而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源,因此,使用普通荧光显微镜时,不推荐使用Cy5。通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。
TRITC(Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate,四甲基异硫氰酸罗丹明)是罗丹明的一种衍生物之一,呈紫红色粉末,较稳定。罗丹明的衍生物还包括Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)等。这些罗丹明衍生物的耦联基团具有不同的吸收波长 (550, 570, 596nm)和zui大发射波长(570, 590, 620nm)。TRITC荧光素能与细胞内蛋白质结合,比FITC稳定性好,在生理条件下对pH值变化不敏感,荧光强度受自发荧光干扰小。TRITC的zui 大激发光波长为550nm,zui大发射光波长为620nm,呈橙红色荧光,与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明,常用于免疫荧光组织化学双重染色。因其荧光 淬灭慢,也可用于单独标记染色。需要注意的是,因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标,另一种用藻红蛋白(PE)耦联基团要比罗丹明好。