禽流感抗体（ AIV-Ab）酶联免疫分析
试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
96T
使用目的：
本试剂盒用于测定血清、血浆及相关液体样本中禽流感抗体（ AIV-Ab）表达。实验原理本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中禽流感抗体（ AIV-Ab）表达。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中禽流感抗体（ AIV-Ab）相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与 HRP标记的抗原结合，形成抗原 -抗体-酶标抗原复合物，经过*洗涤后加底物 TMB显色。 TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度（ OD值），与 CUTOFF值相比较，从而判定标本中禽流感抗体（ AIV-Ab）的存在与否。
试剂盒组成
| 1 | 30倍浓缩洗涤液 | 20ml×1瓶 | 7 | 终止液 | 6ml×1瓶 | | 2 | 酶标试剂 | 6ml×1瓶 | 8 | 阳性对照 | 0.5ml×1瓶 | | 3 | 酶标包被板 | 12孔 × 8条 | 9 | 阴性对照 | 0.5ml×1瓶 | | 4 | 样品稀释液 | 6ml×1瓶 | 10 | 说明书 | 1份 | | 5 | 显色剂 A液 | 6ml×1瓶 | 11 | 封板膜 | 2张 | | 6 | 显色剂 B液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1个 | |
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于 -20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3的样品，因 NaN3抑制辣根过氧化物酶的（ HRP）活性。操作步骤
1.编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照 2孔、阳性对照 2孔、空白对照 1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）
2.加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照 50µl。然后在待测样品孔先加样品稀释液 40µl，然后再加待测样品 10µl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，
3.温育：用封板膜封板后置 37℃温育 3 0分钟。
4.配液：将 30倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30倍稀释后备用
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30秒后弃去，如此重复 5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。
7.温育：操作同 3。
8.洗涤：操作同 5。
9.显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀， 37℃避光显色15分钟.
10.终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零， 450nm波长依序测量各孔的吸光度（ OD值）。测定应在加终止液后 15分钟以内进行。
操作程序总结：
计算和结果判定：试验有效性：阳性对照孔平均值 ≥1.00;阴性对照平均值 ≤0.10临界值（ CUT OFF）计算：临界值 =阴性对照孔平均值 +0.15阴性判定：样品 OD值<临界值（ CUT OFF）者为禽流感抗体（ AIV-Ab）阴性阳性判定：样品 OD值≥临界值（ CUT OFF）者为禽流感抗体（ AIV-Ab）阳性
。注意事项
1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。
2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物请避光保存。
6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为 630nm
7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为 2M的硫酸，使用时必须注意安全。保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期： 6个月
标本收集方法：
1. 血清：
室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
2. 血浆：
应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清
。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
3. 尿液：
用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参
照此实行。
4. 细胞培养上清：
检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。
5. 培养细胞
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试
剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离
心。
6. 组织标本
切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量
的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分
装后一份待检测，其余冷冻备用。
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时间：2012/5/31 
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