建立间接的ELISA方法适合己烯雌酚样本快速检测

己烯雌酚（diethylstibestrol, DES）是一种人工合成的雌激素,在促进动物蛋白质的合成代谢、提高动物日增重和减少脂肪等方面效果明显,因此一直被作为一种动物生长促进剂用于畜禽以及水产品养殖中。癌症研究机构（IARC）研究发现,DES是一种致癌物质,能够在动物源性食品如肝脏、肌肉、蛋、奶中残留,并通过食物链危害人体健康。因此世界各国规定食品动物养殖中不得以任何途径和方式使用DES,养殖动物及动物性食品中不得检出DES。 本论文针对DES的结构特点,设计并合成了DES半抗原和人工抗原,并对DES半抗原和人工抗原进行了表征和鉴定,制备出了己烯雌酚的高质量的多克隆抗体,应用间接ELISA方法和Western Blot测定了抗体的特异性,建立了己烯雌酚的酶联免疫检测方法以及相应的样品提取方法,并且用HPLC方法对ELISA检测方法的精密度和准确度进行了验证。 本文分两部分,*部分对己烯雌酚进行了结构修饰,用有机合成方法合成了己烯雌酚-单-羧基丙基-醚（DES-MCPE）和己烯雌酚半琥珀酸（DES-HS）,并通过红外、质谱和核磁共振对合成产物进行了鉴定之后分别将己烯雌酚衍生产物利用优化的混合酸酐法、碳二亚胺法与牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）偶联,分别作为免疫抗原及包被抗原,并且通过紫外扫描光谱、SDS-PAGE电泳试验验证偶联效果。 第二部分,以合成的DES-HS-BSA, DES-MCPE-BSA免疫新西兰大白兔得到抗血清,优化抗体纯化条件,得到DES抗体,应用Western Blot和间接ELISA法验证了抗体的特异性；探讨了间接ELISA测定DES抗体的条件；并对DES抗体与游离DES的特异性结合反应进行测定。采用碳二亚胺法连接的DES-HS-BSA作为免疫原得到的抗体进行间接竞争ELISA实验,优化了ELISA工作条件,建立了间接竞争ELISA检测DES方法。方阵滴定法确定*OVA-HS-HSA包被抗原的浓度为2.5μg/mLDES-HS-BSA,酶标二抗（羊抗兔IgG-HRP）工作浓度为1：7500以及抗体的工作浓度为1：6400。以上述试验条件为基础,以系列稀释的DES标准溶液作为检测对象,绘制标准曲线,得到的线性回归直线方程为y=-2.6679x+3.0589,相关系数R2=0.9969,从标准曲线可以得知,此方法可测定的zui适范围为Ong/mL～100ng/mL,zui小检测限约为8.4ng/mL。本实验所建立的ELISA方法的度以批内误差表示,结果表明孔间差异2.57%（n=5）,度较好。在可测定浓度范围内己烯雌酚（DES）抗体与其他二苯乙烯类激素免疫交叉反应较小,在添加回收实验中,对猪肉样本在10ng/mL,50ng/mL,100ng/mL三个浓度的平均回收率为109.41%。实验结果表明所建立的间接ELISA方法有较高特异性和选择性,适合己烯雌酚药物残留样本快速检测。

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